Леонид Александрович Шапошников, Святослав Сергеевич Савин, Денис Леонидович Атрошенко, Татьяна Анатольевна Чубарь, Евгений Владимирович Пометун, Владимир Иванович Тишков, Анастасия Александровна Пометун

Инженерия N-концевой последовательности формиатдегидрогеназы из сои GlycineMax

Аннотация.NAD(P)⁺-зависимая формиатдегидрогеназа (FDH, КФ 1.2.1.2.) катализирует окисление формиат-иона при сопряженном восстановлении NAD(P)⁺ до NAD(P)H. Ранее в нашей лаборатории была получена генетическая конструкция с геном soyfdh2, кодирующим изофермент 2 формиатдегидрогеназы из сои Glycinemax (SoyFDH), в котором была удалена нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид, отвечающий за транспорт профермента в митохондрии клеток растений (фермент SoyFDH_L). В настоящей работе получен второй вариант SoyFDH_S, в котором по сравнению с SoyFDH_L последовательность на N-конце была уменьшена и изменена в целях получения начального участка, соответствующего последовательности N-конца в FDH из бактерий Pseudomonassp.101. Далее на N-конец этой и укороченной форм SoyFDH была добавлена последовательность из шести остатков гистидина (His-tag). Все четыре варианта SoyFDH были экспрессированы в клетках E. coliBL21(DE3)CodonPlus, проведена очистка этих ферментов, определены их кинетические параметры и исследована термостабильность. Показано, что в случае SoyFDH_L, аналогичной природному варианту фермента, как с His-tag, так и без него уровень экспрессии выше в два раза по сравнению с укороченным вариантом. Добавление His-tag на N-конец ферментов снижает уровень экспрессии. Изменение последовательности N-конца, а также введение на N-конец последовательности His-tag не оказывает значительного влияния на термостабильность при температуре 50–56 °С, однако за счет более высоких значений энтальпии активации процесса термоинактивации укороченная форма при нормальных значениях температуры стабильнее природной в 3 раза. Сравнение кинетических параметров двух вариантов SoyFDH показывает, что каталитические константы одинаковы, но длинный вариант SoyFDH_L имеет более низкие значения K_M^HCOO–, а короткий – более низкие значения K_M^NAD+. Введение His-tag на N-конец ферментов не оказывает влияния на их кинетические параметры.
Ключевые слова: формиатдегидрогеназа, Glycinemax, белковая инженерия, каталитические параметры, температурная стабильность
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2023-64-3-377-390

  Полный текст статьи в формате PDF

Вестник Московского Университета.
Химия 2023, том 64, № 4, стр. 377-390